روش‌ بررسی

تعداد ۳۰ عدد نمونه آندومتر در فاز پرولیفراتیو، ۳۰ عدد نمونه آندومتر هیپرپلازی (۲۰ عدد هیپرپلازی ساده، هشت عدد هیپرپلازی پیچیده با آتیپی و دو عدد هیپرپلازی پیچیده بدون آتیپی) و ۳۰ عدد نمونه کارسینوم آندومتر از نوع اندومتریوئید انتخاب شد. تمامی نمونه‌ها به‌طریقه کورتاژ به‌دست آمده و از آرشیو بخش پاتولوژی بیمارستان میرزاکوچک خان خارج گردید. پس از بازبینی مجدد کلیه لام‌ها، مواردی‌که همراه پولیپ، آندومتریت و یا اثرات پروژسترونی بود، حذف گردید. سپس از هر نمونه یک بلوک پارافینی انتخاب و با ضخامت دو میکرون برش‌خورده و رنگ‌آمیزی IHC با استفاده از کیت Histostain-Plus مربوط به کمپانی zymed آمریکا و آنتی‌بادی anti PTEN zymed's polyclonal Rabbit صورت گرفت. بافت پروستات به‌عنوان کنترل مثبت و یک‌مورد بدون اضافه کردن آنتی‌بادی به‌عنوان کنترل‌منفی در هر ران (run) کاری گذاشته شد. ایمنوراکتیویته مثبت زمانی در نظر گرفته شد که رنگ قهوه‌ای به‌صورت لوکالیزه در سیتوپلاسم سلول‌های اپی‌تلیالی غددی نرمال یا تومورال دیده شد. برای بررسی شدت رنگ‌پذیری سلول‌های اپی‌تلیال بر‌اساس اطلاعات موجود در بروشور کیت و مقالات مختلف کار شده در این زمینه به‌شکل کیفی و نیمه کمّی در نظر گرفته شد.^{۱۲و۱۱و۷و۴} در شکل کیفی بر اساس وجود هر گونه تغییر رنگ قهوه‌ای در سیتوپلاسم سلول‌های اپی‌تلیال غددی و در نوع نیمه کمّی به دو صورت بررسی شد. در یک حالت با در نظر گرفتن ۱۰% cut-point به نحوی‌که حداقل ۱۰% سیتوپلاسم سلول‌های اپی‌تلیالی غدد رنگ‌گرفته باشد و در حالت دیگر با ۵۰% cut- point به نحوی‌که حداقل ۵۰% سیتوپلاسم سلول‌های اپی‌تلیال غدد رنگ‌گرفته باشد. نتایج حاصله توسط نرم‌افزار SPSS ویراست ۱۵ مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت. لازم به ذکر است که از مجموع ۹۰ مورد بررسی شده، سه مورد به‌ترتیب مربوط به فاز پرولیفراتیو، هیپرپلازی ساده و کارسینوم آندومتر به‌علت ریختن بافت هنگام رنگ‌آمیزی IHC از مطالعه حذف گردید.

یافته‌ها

نتایج رنگ‌آمیزی ایمنوهیستوشیمی PTEN به‌صورت کیفی در جدول ۱ و نیمه کمّی با cut-point ۱۰ و ۵۰% در جداول ۲ و ۳ آمده است. ۲۹ مورد آندومتر پرولیفراتیو، تماماً رنگ گرفته (۱۰۰%)، در هیپر-پلازی از ۲۹ مورد، ۲۷ مورد رنگ گرفته (۹۳%) و در کارسینوم آندومتر از ۲۹ مورد، ۱۸ مورد رنگ گرفت (۱/۶۲%) که از نظر آماری تفاوت معنی‌داری بین عدم رنگ‌پذیری در نمونه‌های کارسینوم با نمونه‌های هیپرپلازی و آندومتر پرولیفراتیو وجود دارد. (۰۰۰۱/۰p<) در حالت نیمه کمّی با ۱۰% cut-point: در آندومتر پرولیفراتیو ۲۹ مورد رنگ‌گرفته (۱۰۰%) در هیپرپلازی ۲۶ مورد (۷/۸۹%) رنگ گرفته و در کارسینوم آندومتر ۱۴ مورد (۳/۴۸%) رنگ گرفته بود که در اینجا نیز تفاوت معنی‌دار بین کارسینوم آندومتر، هیپرپلازی و آندومترپرولیفراتیو وجود دارد (۰۰۰۱/۰p<). در ۵۰% cut-point: ۲۹ مورد اندومتر پرولیفراتیو رنگ‌گرفته (۱۰۰%). در هیپرپلازی ۲۵ مورد رنگ‌گرفته (۲/۸۹%) و در کارسینوم آندومتر ۱۳ مورد رنگ گرفته بود (۸/۴۴%) که در اینجا نیز تفاوت معنی‌دار بین کارسینوم آندومتر، هیپرپلازی و آندومتر پرولیفراتیو دیده می‌شود (۰۰۰/۰p<). جدول ۴ نیز مقایسۀ دو به دو گروه‌های مختلف را با یکدیگر بر اساس تست Post Hoc Dunnette T۳ نشان می‌دهد، که با ۹۵% Confidence Interval تفاوت معنی‌داری بین فاز پرولیفراتیو و هیپرپلازی وجود نداشته در حالی‌که تفاوت معنی‌دار بین آندومتر پرولیفراتیو و کارسینوم آندومتر و همین‌طور بین هیپرپلازی و کارسینوم آندومتر دیده می‌شود. جدول ۵ همین‌مقایسه را بین حالات مختلف هیپرپلازی با یکدیگر نشان می‌دهد. در بررسی ما تفاوت معنی‌داری بین هیپرپلازی ساده و هیپرپلازی پیچیده بدون آتیپی دیده نشد. علاوه بر این تفاوت معنی‌داری نیز بین هیپرپلازی پیچیده با و بدون آتیپی به‌دست نیامد. ولیکن تفاوت معنی‌داری بین هیپرپلازی ساده و هیپرپلازی پیچیده با آتیپی دیده شد. در ۱۰% cut-point تمامی ۱۹ مورد هیپرپلازی ساده (۱۰۰%)، از دو مورد هیپرپلازی پیچیده بدون آتیپی یک مورد (۵۰%)، از هشت مورد هیپرپلازی ساده با آتیپی شش مورد (۷۵%) و از ۲۹ مورد کارسینوم آندومتر ۱۴ مورد (۳/۴۸%) رنگ گرفتند (۰۰۵/۰p=). در ۵۰% cut-point از ۱۹ مورد هیپرپلازی ساده، ۱۸ مورد (۷/۹۴%)، از دو مورد هیپرپلازی پیچیده بدون آتیپی، یک مورد (۵۰%)، از هشت مورد هیپرپلازی پیچیده با آتیپی، شش مورد (۷۵%) و از ۲۹ مورد کارسینوم آندومتر ۱۳ مورد (۸/۴۴%) رنگ گرفتند که ۰۰۱/۰p= بود. بروز ایمنوراکتیویته PTEN در لام‌ها به‌شکل هموژن و هتروژن (ناهمگون) بود. به نحوی‌که در برخی موارد سیتوپلاسم تمامی سلول‌های یک غده رنگ گرفته (هموژن) و در کانون‌هایی دیگر رنگ‌پذیری در سیتوپلاسم برخی از سلول‌های یک غده دیده می‌شد و البته به این نکته در مقالات نیز اشاره شده است.^۲ علاوه بر این رنگ‌پذیری مثبت در هسته و سیتوپلاسم سلول‌های استروما نیز دیده شد که خود به‌عنوان کنترل مثبت نیز در نظر گرفته شد. همچنین پایین‌ترین شدت رنگ‌پذیری در کارسینوم اندومتریوئید و بالاترین شدت رنگ‌پذیری در فاز پرولیفراتیو اولیه شناسایی شد. بروز شدت رنگ‌پذیری PTEN در آندومتر پرولیفراتیو و هیپرپلازی ساده به نحو قابل توجهی بیش‌از کارسینوم اندومتریوئید بود.

بحث

نئوپلازی اغلب به‌عنوان پدیده‌ای ناشی از بروز وقایعی که بر روی کنترل پرولیفراسیون سلولی تاثیر می‌گذراند، در نظر گرفته می‌شود و لیکن در واقع توانایی سلول جهت سرباز زدن از مرگ برنامه‌ریزی شده نیز یک نقش مهم در سرطان‌زایی دارد.^۳ موتاسیون ژن PTEN شایع‌ترین تغییر ژنتیکی در کارسینوم و هیپرپلازی آندومتر (به‌عنوان یک ضایعه پیش سرطانی) می‌باشد.^۵و۳ PTEN نه تنها دارای یک نقش مهم در توقف چرخه سلولی و آپوپتوز برنامه‌ریزی شده بوده، بلکه همچنین در دیگر جنبه‌های فیزیولوژی سلولی شامل تنظیم چسبندگی، مهاجرت و تمایز سلول نقش دارد. در هیپرپلازی آندومتر که یک ضایعه پیش سرطانی می‌باشد، از بین رفتن بروز PTEN در ۶۳-۳۰% موارد دیده می‌شود.^۵ در مطالعۀ Orbo ۶۸ نمونه هیسترکتومی و D&C بیماران با تشخیص هیپرپلازی آندومتر مورد بررسی قرار گرفت که ۱۸ مورد همزمان دارای کارسینوم آندومتر نیز بودند. از ۱۸ مورد دارای کارسینوم آندومتر همزمان، ۵۵% از بین رفتن بروز PTEN را نشان داده در حالی‌که در ۵۰ مورد باقیمانده با تشخیص هیپرپلازی تنها ۸% از بین رفتن بروز PTEN را نشان دادند.^۱۲ در همین مطالعه کارسینوم آندومتر در ۴۴%، ۱۰% و ۰% بیماران با تشخیص به‌ترتیب هیپرپلازی پیچیده با آتیپی، هیپرپلازی پیچیده بدون آتیپی و هیپرپلازی ساده دیده شد. در مطالعه ما با روش نیمه کمّی در ۱۰% cut-point از بین رفتن بروز PTEN ۰%، ۰%، ۳۰%، و ۷/۵۱% در فاز پرولیفراتیو، هیپرپلازی ساده، هیپرپلازی پیچیده و کارسینوم اندومتر-یوئید دیده شد و در ۵۰% cut-point ۰%، ۳/۵%، ۳۰% و ۵۵% در فاز پرولیفراتیو، هیپرپلازی ساده، هیپرپلازی پیچیده و کارسینوم اندومتر-یوئید دیده شد. ایمنوراکتیویته PTEN در فاز پرولیفراتیو و هیپرپلازی ساده عمدتا به‌صورت هموژن بود به نحوی‌که سیتوپلاسم تمامی سلول‌های اپی‌تلیال با شدت بالا و بالای ۵۰% (به‌جز یک مورد در هیپرپلازی ساده) رنگ گرفته بودند. در حالی‌که ایمنوراکتیویته در هیپرپلازی پیچیده با آتیپی بیشتر به‌صورت هتروژن بود. سیتوپلاسم برخی از غدد به‌طور کامل رنگ‌پذیری را نشان داده ولی در غدد دیگر عدم رنگ‌پذیری در سیتوپلاسم تعدادی از سلول‌های آن غدد دیده می‌شد و این نتیجه با گزارشات سایر مقالات دیگر نیز هم‌خوانی داشت.^۳ Mutter از بین رفتن بروز PTEN را در ۵۵% و۶۳% تشخیص Endometrioid Intraepithelial Neoplasia (EIN) در دو مطالعه مختلف گزارش کرد.^۱۳و۵ لازم به ذکر است که در رفرانس‌های جدید EIN مشابه هیپرپلازی پیچیده با آتیپی در نظر گرفته شده و در بسیاری از موارد EIN با هیپرپلازی پیچیده با آتیپی هم‌پوشانی دارد.^۱۴ بر اساس WHO بیشتر ضایعات EIN به‌عنوان هیپرپلازی پیچیده با آتیپی در نظر گرفته می‌شوند.^۱۵ علاوه بر این بر اساس جدول ۵ در بررسی ما با مقایسه بروز PTEN در هیپرپلازی ساده و هیپرپلازی پیچیده بدون آتیپی و همچنین هیپرپلازی پیچیده با آتیپی با هیپرپلازی پیچیده بدون آتیپی و مقایسه هیپرپلازی پیچیده با آتیپی با کارسینوم اندومتریوئید این تفاوت معنی‌دار نبوده در حالی‌که با مقایسه هیپرپلازی ساده و هیپرپلازی پیچیده با آتیپی این تفاوت به نحو قابل ملاحظه‌ای معنی‌دار می‌باشد. (confidence interval ۹۵%) به‌هرحال تنها در سه مورد هیپرپلازی پیچیده که دو مورد آن با آتیپی همراه بود، PTEN به‌طور کامل بروز پیدا نکرده بود و در بقیه موارد بروز آن به‌شکل هتروژن بود که شاید یکی از دلایل آن ریزش غدد در طی سیکل ماهیانه باشد. عدم بروز PTEN در ۸۳-۸/۴۵% موارد کارسینوم آندومتر گزارش شده است.^۱۳و۵و۴ عدم بروز PTEN در مطالعه ما در بررسی کیفی: ۹/۳۷%، نیمه کمّی با ۱۰% cut-point: ۷/۵۱% و ۵۰% cut-point: ۲/۵۵% بود. علاوه بر این با مقایسه بروز PTEN در فاز پرولیفراتیو و هیپرپلازی این تفاوت معنی‌دار نبوده ولیکن با مقایسه فاز پرولیفراتیو و کارسینوم آندومتریوئید و همچنین هیپرپلازی با کارسینوم آندومتریوئید تفاوت معنی‌دار به‌دست آمد (جدول ۴). تشخیص افتراقی هیستوپاتولوژیک بین کارسینوم آندومتر و هیپرپلازی پیچیده با آتیپی می‌تواند بسیار مشکل باشد^۱۶ و تکرارپذیری طبقه‌بندی WHO برای تشخیص هیپرپلازی ناامید کننده است.^۱۶ یافته‌های به‌دست آمده در مطالعه ما قابل مقایسه با یافته‌های مقالات دیگر می‌باشد که تفاوت معنی‌دار آماری قابل ملاحظه‌ایی بین کارسینوم آندومتر و هیپرپلازی پیچیده با آتیپی به‌دست نیامد^۳ و این می‌تواند مطابق با هیپوتزی که بیان‌گر پیش‌ساز بودن هیپرپلازی پیچیده با آتیپی در کارسینوم آندومتر است، باشد. علاوه بر این کم بودن تعداد نمونه‌های هیپرپلازی پیچیده بدون آتیپی نیز از مواردی است که می‌تواند بر روی نتایج ما تأثیر داشته باشد و شاید اگر این تعداد بیشتر می‌بود نتایج قابل اعتماد بودند (پایین‌تر از ۵۰%) و همچنین ما از آنتی بادی پلی کلونال استفاده کردیم در حالی‌که بر اساس یک مطالعه جدید^۷ آنتی بادی مونوکلونال ۶٫H۲.۱ دارای نتایج قابل قبول‌تری با تغییرات غیر فعال شدن PTEN در حالات تومورال می‌باشد. تفاوت آماری معنی‌داری در بروز PTEN بین هیپرپلازی بدون آتیپی و کارسینوم اندومتریوئید پیدا کردیم ولی تفاوت معنی‌داری بین هیپرپلازی پیچیده با آتیپی و کارسینوم اندومتریوئید پیدا نشد و از آنجایی‌که تصور می‌شود هیپرپلازی پیچیده با آتیپی پیش‌ساز کارسینوم اندومتریوئید باشد،^۱۷ ممکن است این جهش ژنی در اولین مراحل تومورزایی اتفاق افتاده باشد. علاوه بر این به‌نظر می‌آید بین روش‌های کیفی و نیمه کمّی با cut-point ۱۰% و ۵۰%، روش نیمه کمّی با ۱۰% cut-point دارای نتایج بهتری در مقایسه با دو روش دیگر باشد. بر این اساس در مطالعه ما فاز پرولیفراتیو به‌طور کامل بروز PTEN را نشان داده و عدم بروز PTEN در هیپرپلازی ساده ۰% در هیپرپلازی پیچیده ۳۰% و در کارسینوم اندومتریوئید ۷/۵۱% دیده شد.

References

۱.       Hayes MP, Wang H, Espinal-Witter R, Douglas W, Solomon GJ, Baker SJ, et al. PIK۳CA and PTEN mutations in uterine endometrioid carcinoma and complex atypical hyperplasia. Clin Cancer Res ۲۰۰۶; ۱۲: ۵۹۳۲-۵.

۲.       Kapucuoglu N, Aktepe F, Kaya H, Bircan S, Karahan N, Ciriş M. Immunohistochemical expression of PTEN in normal, hyperplastic and malignant endometrium and its correlation with hormone receptors, bcl-۲, bax, and apoptotic index. Pathol Res Pract ۲۰۰۷; ۲۰۳: ۱۵۳-۶۲.

۳.       An HJ, Lee YH, Cho NH, Shim JY, Kim JY, Lee C, et al. Alteration of PTEN expression in endometrial carcinoma is associated with down-regulation of cyclin-dependent kinase inhibitor, p۲۷. Histopathology ۲۰۰۲; ۴۱: ۴۳۷-۴۵.

۴.       Erkanli S, Kayaselcuk F, Kuscu E, Bagis T, Bolat F, Haberal A, et al. Expression of survivin, PTEN and p۲۷ in normal, hyperplastic, and carcinomatous endometrium. Int J Gynecol Cancer ۲۰۰۶; ۱۶: ۱۴۱۲-۸.

۵.       Mutter GL. Diagnosis of premalignant endometrial disease. J Clin Pathol ۲۰۰۲; ۵۵: ۳۲۶-۳۱.

۶.       Pallares J, Bussaglia E, Martínez-Guitarte JL, Dolcet X, Llobet D, Rue M, et al. Immunohistochemical analysis of PTEN in endometrial carcinoma: a tissue microarray study with a comparison of four commercial antibodies in correlation with molecular abnormalities. Mod Pathol ۲۰۰۵; ۱۸: ۷۱۹-۲۷.

۷.       Mutter GL, Lin MC, Fitzgerald JT, Kum JB, Baak JP, Lees JA, et al. Altered PTEN expression as a diagnostic marker for the earliest endometrial precancers. J Natl Cancer Inst ۲۰۰۰; ۹۲: ۹۲۴-۳۰.

۸.       Haines S, Fax H, Welles M. Haines & Taylor's Gynecological and Obstetrical Pathology. ۵^th ed. Spine: Churchill Livingstone: ۲۰۰۳.

۹.       Zaino RJ, Kauderer J, Trimble CL, Silverberg SG, Curtin JP, Lim PC, et al. Reproducibility of the diagnosis of atypical endometrial hyperplasia: a Gynecologic Oncology Group study. Cancer ۲۰۰۶; ۱۰۶: ۸۰۴-۱۱.

۱۰.    Mutter GL, Duska LR, Crum CP. Endometrial intraepithelial neoplasia. In: Crum C, Lee KR, editors. Diagnostic Gynecologic and Obstetric Pathology. Philadelphia, Pa: Elsevier Saunders; ۲۰۰۶. p. ۴۹۴.

۱۱.    Tringler B, Gup CJ, Singh M, Groshong S, Shroyer AL, Heinz DE, et al. Evaluation of p۱۶INK۴a and pRb expression in cervical squamous and glandular neoplasia. Hum Pathol ۲۰۰۴; ۳۵: ۶۸۹-۹۶.

۱۲.    Mutter GL, Ince TA, Baak JP, Kust GA, Zhou XP, Eng C. Molecular identification of latent precancers in histologically normal endometrium. Cancer Res ۲۰۰۱; ۶۱: ۴۳۱۱-۴.

۱۳.    Orbo A, Nilsen MN, Arnes MS, Pettersen I, Larsen K. Loss of expression of MLH۱, MSH۲, MSH۶, and PTEN related to endometrial cancer in ۶۸ patients with endometrial hyperplasia. Int J Gynecol Pathol ۲۰۰۳; ۲۲: ۱۴۱-۸.

۱۴.    Cotran RS, Kumar V, Collins T. Robbin's pathologic basis of disease. ۶^th ed. Philadelphia: Saunders: ۱۹۹۹.

۱۵.    George L. Available from: [http://www.endometrium.org]. October ۲۹: ۲۰۰۲.

۱۶.    Taranger-Charpin C, Carpentier S, Dales JP, Garcia S, Djemli A, Andrac L, et al. Immunohistochemical expression of PTEN antigen: a new tool for diagnosis of early endometrial neoplasia. Bull Acad Natl Med ۲۰۰۴; ۱۸۸: ۴۱۵-۲۷.

۱۷.    Brigitte M, Kurman RJ, Kurman R. Perecursor lesions of endometrial carcinoma in: Kurman RJ, Blaustein A. Blaustein's pathology of the female Genital tract. ۵^th ed. New York: Springer-Verlag: ۲۰۰۲.